TopHat 是一款面向 RNA-Seq 数据的剪接连接比对软件，由约翰斯·霍普金斯大学计算生物学中心的 Daehwan Kim、Steven Salzberg 与华盛顿大学 Genome Sciences Department 的 Cole Trapnell 合作开发，最初由 Cole Trapnell 在马里兰大学 College Park 的生物信息学与计算生物学中心开发。它使用超高通量短读段比对器 Bowtie，将 RNA-Seq 读段定位到哺乳动物规模的基因组，再分析比对结果，识别外显子之间的剪接连接。与只进行常规短序列比对的工具相比，TopHat 的核心处理对象是跨越剪接位点的 RNA-Seq 读段，并可进一步处理潜在融合点、插入缺失和多种输入及注释格式。
核心功能
RNA-Seq 读段基因组比对
TopHat 以 RNA-Seq reads 为输入，先使用 Bowtie 进行高通量短读段比对，再对未能直接比对的读段进行后续剪接相关分析。TopHat 2 默认使用 Bowtie2（如果系统中存在），也可以回退到 Bowtie 1；SOLiD 的 Colorspace reads 仍需要较旧版本的 Bowtie，因为 Bowtie 2 不支持这类读段。程序支持单端和 paired-end 读段，并能处理 variable-length reads。
剪接连接发现
软件会分析读段映射结果，识别外显子之间的 splice junctions，并将发现的剪接连接与提供的注释结合。使用 -G/--GTF 提供已知转录本时，TopHat 可以先将读段映射到转录组，再把未映射读段送入全基因组比对和新剪接连接发现流程。运行结果包括剪接连接相关输出，官网还提到 junctions.bed 文件以及包含读段或读段对输入和映射计数的 align_summary.txt。
融合点比对与融合转录本发现
TopHat 2 增加了跨越 fusion points 的读段比对能力，这些融合点可能来自基因组易位、read-through transcription 或 trans-splicing。该功能整合了此前 TopHat-Fusion 中的融合发现引擎，但融合映射是可选功能。2.1.0 版本改进了 TopHat-Fusion 对融合的发现，并通过计算读段对的 inner distance 来统计支持融合的 read pairs，默认 inner distance 阈值为 250 个碱基对，也可通过 --fusion-pair-dist <int> 设置。
插入缺失与比对细节控制
TopHat 能够利用 RNA-Seq 数据检测 insertions 和 deletions，并使用 SAM 格式规定的 I 与 D CIGAR 操作报告跨越发现的插入缺失的读段；每次运行发现的 indels 还会输出为 BED 文件。用户可以通过 --read-gap-length、--read-edit-dist 等选项限制错配、indel 数量和 indel 长度，也可以用 --read-realign-edit-dist 强制重新映射部分或全部读段，以改善剪接比对，尤其是在缺少注释数据时。
多格式输入与结果输出
TopHat 可以自动检测每个输入文件是 FASTA 还是 FASTQ 格式，也支持 gzip 或 bzip2 压缩的 FASTQ/FASTA 文件并在运行中解压。TopHat 2 的比对结果以 BAM 格式报告，并可报告主要比对之外的次级比对，默认最多报告 20 个 paired 或 single alignments。bam2fastx 还可以作为独立工具，将 BAM/SAM 转换为 FASTQ/FASTA；其输出目录可包含 accepted_hits.bam、unmapped.bam 以及 align_summary.txt 等文件。
并行化与运行恢复
TopHat 2 将流程中多数耗时步骤进行了并行化，在多处理器系统上可以减少总运行时间。软件支持通过 -R/--resume <tophat_out> 恢复提前终止的 TopHat 运行；早期版本还加入了对临时数据压缩的处理，以减少运行过程中的磁盘占用和磁盘 I/O。具体运行参数、安装步骤和特殊用法由官网的 Getting started、Manual、FAQ 与 Protocol 页面提供。
使用方式
官网提供 TopHat 2.1.1 的源代码包、Linux x86_64 二进制包和 Mac OS X x86_64 二进制包，版本发布日期为 2016 年 2 月 23 日。使用者需要在本地安装或编译软件，并通过命令行选项运行 RNA-Seq 比对流程；从源代码构建 TopHat 2 时需要安装 Boost。官网还提供 iGenomes 索引和注释下载入口，以及包含安装说明的教程。正文没有提到注册流程、Web 端界面或 API，也没有说明需要自备模型 Key。
适用人群与场景
进行 RNA-Seq 数据分析的生物信息学研究者，可以使用 TopHat 将读段比对到基因组并发现剪接连接。需要处理已知转录本注释的用户，可以提供 GTF 文件，先进行转录组映射，再对未映射读段开展全基因组和新连接搜索。研究基因组易位、read-through transcription 或 trans-splicing 的用户，可以启用可选的融合点映射。需要把比对结果交给后续转录本组装、表达量计算或可视化工具的用户，可以将 TopHat 与 Cufflinks、CummeRbund 以及能读取 BAM 文件的浏览器配合使用。
注意事项
官网明确说明 TopHat 已进入“low maintenance, low support”阶段，核心功能已很大程度上被 HISAT2 取代，HISAT2 提供相同的 RNA-Seq reads 剪接比对核心功能，并且准确性更高、效率更高。当前页面列出的 TopHat 2.1.1 是维护版本，发布时间为 2016 年。使用 Bowtie2 进行融合搜索仍被说明处于开发阶段，可能需要较多内存并产生许多伪阳性融合；旧版 TopHat 页面还指出 Colorspace reads 需要 Bowtie 1，且从源码构建 TopHat 2 需要 Boost。
